摘要：在地表水中水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)糞大腸菌群具有重要的作用。而酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群具有較準(zhǔn)確、速度快、操作簡單等特點(diǎn)，是一項(xiàng)新的技術(shù)。

1、方法原理

在特定溫度下培養(yǎng)特定的時(shí)間, 糞大腸菌群能產(chǎn)生酶底物法采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶, 將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯β-D-吡喃半乳甘糖分解黃色的鄰硝基苯酚, 在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。統(tǒng)計(jì)陽性反應(yīng)出現(xiàn)的數(shù)量, 查MPN圖表, 在將其計(jì)算出樣品中糞大腸菌群的濃度值。其酶底物法檢出限是10MPN/L。

2、實(shí)驗(yàn)室用水

實(shí)驗(yàn)室用水為無菌水, 取來適量的純凈水, 放在燒杯中, 經(jīng)過121攝氏度, 高壓蒸汽滅菌, 需要20分鐘。

3、采樣瓶的清洗準(zhǔn)備

(1) 是新購買的500ml具旋帽或者是磨口塞得廣口玻璃瓶, 應(yīng)在百分之二的鹽酸中浸泡幾個(gè)小時(shí), 還需要用自來水沖洗干凈, 再用純凈水清洗1-2次, 控干, 備用。

(2) 將清洗干凈干燥的采樣器, 用專用的紙包裹起來, 放入恒溫干燥箱內(nèi), 將溫度設(shè)置到121攝氏度, 滅菌20分鐘, 烘干。滅菌完成后, 還需要關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室電源待溫度降到50攝氏度以下時(shí), 方可開門取樣品瓶, 不然, 玻璃瓶會(huì)因?yàn)椴僮鞑划?dāng)爆裂。

4、樣品的采集及保存

(1) 單獨(dú)采樣, 優(yōu)先采樣。使用已經(jīng)準(zhǔn)備好的采樣瓶, 采樣。在采樣的過程中產(chǎn)樣瓶不用再進(jìn)行沖洗。

(2) 在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí), 應(yīng)自上而下進(jìn)行采樣, 以免不同層次的攪擾。

(3) 水樣的保存條件及時(shí)間:水樣應(yīng)在10攝氏度以下冷藏保存;應(yīng)盡快分析, 最長時(shí)間不能超過6個(gè)小時(shí)。

(4) 化驗(yàn)員接樣后, 不能立即檢測(cè), 應(yīng)將樣品與4攝氏度以下冷藏并在2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

5、分析樣品

5.1、樣品稀釋

需要根據(jù)樣品污染程度確定接種量, 避免接種樣品培養(yǎng)后97孔定量盤出現(xiàn)全部陽性或全部陰性。在接種量小于100ml的時(shí)候, 應(yīng)稀釋樣品后再進(jìn)行接種試驗(yàn), 接種量為10ml的時(shí)候, 取10ml樣品加入到90ml無菌水的三角瓶中混合均勻制成1:10的稀釋樣品, 其他接種量的稀釋樣品依次類推。在未知樣品, 可選用多個(gè)接種量進(jìn)行檢測(cè)。

5.2、接種

量取100ml樣品或是稀釋樣品與滅菌后的三角瓶, 再加入2.7克+-0.5克培養(yǎng)基粉末, 在充分?jǐn)嚢杌靹? 等完全溶解, 在將其全部倒入97孔定量盤內(nèi), 以手扶平97孔定量盤背面, 趕出孔內(nèi)氣泡, 然后, 用程控定量封口機(jī)封口。觀察97孔定量盤顏色, 若出現(xiàn)類似或者深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤的顏色, 則還需要進(jìn)行樣品排查、培養(yǎng)基無菌水等一系列因素后, 終止實(shí)驗(yàn)或重新實(shí)驗(yàn)。

5.3、培養(yǎng)

測(cè)定糞大腸菌群時(shí), 將封口后的97孔定量盤, 放入恒溫培養(yǎng)箱中, 在44.5攝氏度+-0.5攝氏度下, 培養(yǎng)24小時(shí)。

5.4、對(duì)照實(shí)驗(yàn)

(1) 空白對(duì)照

每次實(shí)驗(yàn)都要用無菌水按照分析步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色, 不然, 該實(shí)驗(yàn)失敗, 應(yīng)重新測(cè)定。

(2) 陽性與陰性對(duì)照

將糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300-3000個(gè)/ml的菌懸液, 將菌懸液按接種和培養(yǎng)要求操作, 陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng);陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng);否則, 結(jié)果無效, 實(shí)驗(yàn)失敗, 重新測(cè)定。

(3) 結(jié)果判讀及計(jì)數(shù)和有效位數(shù)的要求

將培養(yǎng)24小時(shí)的97孔定量盤進(jìn)行結(jié)果讀數(shù), 樣品出現(xiàn)變黃色判斷為糞大腸菌群陽性。測(cè)定結(jié)果保留2位有效數(shù)字。

5.5、結(jié)果計(jì)算與表示

從97孔定量盤法MPN表中查的每100ml水樣中糞大腸菌群的MPN值, 在根據(jù)樣品稀釋度不同, 按照公式換算樣品中糞大腸菌群濃度。

結(jié)語

本文通過對(duì)糞大腸菌群檢測(cè)方法酶底物法以其操作簡便、檢測(cè)周期短將在未來取代多管發(fā)酵法、濾膜法等傳統(tǒng)方法, 尤其是酶底物法采用密封培養(yǎng)技術(shù)。